8(495)120-60-59
г. Москва, Научный проезд, дом 17, офис 5-2

Видео

21.02.2017 AgraQuant Mycotoxin ELISA

21.02.2017 AgraStrip Allergen

21.02.2017 AgraStrip Gluten G12

Новости

Микросферный мультиплексный анализ в ветеринарной диагностике.

Микросферный мультиплексный анализ в ветеринарной диагностике.

Губин Ярослав Алексеевич, ветеринарный врач-биохимик, ведущий менеджер ООО «ЗИПИ» (г. Москва) 
Александр Валентинович Машнин, к.в.н., руководитель проектов 
ООО «ЗИП-И»(г. Омск) 
Дмитрий Валентинович Машнин, к.в.н., региональный представитель компании 
ООО «ЗИП-И» по Приволжскому и Уральскому федеральным округам(г. Омск) 
На основании статьи: Christopher-Hennings J, Araujo KP, Souza CJ, Fang Y, Lawson S, Nelson EA, Clement T, Dunn M, Lunney JK: Opportunities for bead-based multiplex assays in veterinary diagnostic laboratories. J VetDiagnInvest. 2013, 25: 671-691. 10.1177/1040638713507256. 

Введение 

 В настоящее время в лабораторной диагностике есть стойкая тенденция перехода от единичных методов исследования к мультиплексным. Это обусловлено тем, что всё чаще в диагностике необходимы комплексные результаты по нескольким аналитам. В зависимости от целей исследования это может быть комплекс из нескольких заболеваний со схожей симптоматикой или объединённые по иному признаку, различные штаммы одного типа возбудителя, набор мишеней для генотипирования или детектирование набора различных цитокинов для определения силы и типа иммунного ответа. Решение перечисленных диагностических задач с помощью традиционных методов, таких как ИФА или ПЦР, за счёт большого количества аналитов становится достаточно дорогим за счёт большого количества необходимых для анализа рабочего времени, тест-наборов (отдельного на каждый аналит), большого количества расходных материалов и тестируемого образца. 

 Сейчас широко распространённый в медицине метод мультиплексного анализа на базе микросфервсё шире распространяется в ветеринарной диагностике Европы и Америки, и только начинает использоваться ветеринарами России и стран СНГ. Микросферный мультиплексный анализ (МСМА) является методом получения мультианалитного профиля. Метод МСМА применим в качестве высокопроизводительного одновременного обнаружения и количественного определения большого количества аналитов в растворе. Обычно в ветеринарии в качестве аналита могут выступать иммунные белки организмахозяина (т.е. антитела, иммуноглобулин [Ig] или иммунные цитокины) или инфекционного агента, таких как вирусы, бактерии, грибы или простейшие. В отличие от таких методов, как иммуноферментный анализ (ИФА), метод микрочипов, Вестерн-блоттинг или полимеразная цепная реакция (ПЦР, Рис.1), метод МСМА существенно уменьшает количество необходимого для анализа времени и количества образца, и позволяет одновременно тестировать множество образцов на большое количество аналитов. Так как для одновременного обнаружения множества аналитов необходим лишь небольшой объём образца, то МСМА хорошо подходит для анализа в случаях ограниченного объёма проб. 

 Метод позволяет получать результаты по нескольким, до сотен, аналитов в одной пробе.Количество аналитов зависит от специфики диагностического набора и типа используемого прибора. В медицине уже доступно множество диагностических наборов, таких, например, как Панель Респираторных Вирусов (RVP), которая одновременно обнаруживает и определяет 8 типов и подтипов вирусов, или Панель Желудочно-кишечных Патогенов (GPP),одновременно определяющая 14 бактерий или бактериотоксинов, 3 вируса и 3 паразитов. Доступно множество наборов для обнаружения и количественного определения иммунных цитокинов, факторов роста и их рецепторов, провоспалительных протеинов, киназ и ингибиторов, патогенов, антител (для изотипирования или антиген-специфические антитела) нейробиологических протеинов, факторов транскрибции, для генотипирования, определения регуляторов метаболизма, онко- и кардиомаркеров, аллергенов, гормонов, тканевых антигенов (т.е. лейкоцитарные антигены человека [HLAs]), но эти наборы разработаны для исследования человека, приматов и некоторых видов грызунов. 


Рисунок1. Приблизительное сравнение максимального количества аналитов и образцов, которые можно проанализировать с помощью микрочипов, иммуноферментного анализа (ИФА), микросферногомультиплексногоанализа (МСМА) и полимеразнойцепной реакции (ПЦР).Заштрихованные столбцы диаграмы–максимальное количество аналитов; однородные столбцы– максимальное количество образцов. Для сельскохозяйственных животных МСМА-тесты на данный момент разработаны, но в качестве коммерческих наборов доступны лишь некоторые. В следующие несколько лет ожидается появление и/или коммерциализация многих подобных тестов для использования в рутинной ветеринарной диагностике. Ниже приведены преимущества мультиплексного анализа (Таблица 1). 

Таблица 1. Преимущества использования МСМА в ветеринарной лабораторной диагностике. 

Возможность одновременного тестирования большого количества образцов на большое кол-во показателей. 

Гибкая система комбинирования наборов (1-500 аналитов) для различных вариантов применения. 

Наборы можно «настраивать», так как в зависимости от целей можно добавлять или убирать микросферы. 

Эффективная оценка сопутствующих инфекций. 

Тестирование на несколько показателей, которые ранее на основании клинической картины не рассматривались. 

Диагностические панели устраняют человеческий фактор при выборе теста (например, выбор бактериальных тестов в то время, как причина может быть вирусной, или наоборот; то же в случае с паразитарными заболеваниями). 

Возможность создавать или использовать наборы для одновременного определения различных изолятов, штаммов или генотипов определённого возбудителя. 

Платформа «с открытым исходным кодом» легко поддается внутреннему анализу, не требующему дорогостоящих и эксклюзивных реагентов. 

Стоимость исследования в пересчёте на аналит ниже многих других технологий. 

Стоимость существенно снижается при комбинировании большего числа аналитов в одном тесте. 

Реакции, проходящие в жидкой фазе, как правило, быстрее и дают более воспроизводимые результаты, чем твердофазный анализ на плоскости. 

Уменьшенное время анализа благодаря увеличенной скорости реакции на микросферах в жидкости, и без необходимости ферментативных реакций. Для анализа требуется меньшее количество образца. 

Принцип метода

Технология МСМА основана на использовании лигандов (т.е. пептиды, нуклеотиды, белки, антитела, рецепторы, полисахариды или липиды), которые присоединены к флуоресцентным сферам (Рис. 2). Лиганды во время анализа будут специфично соединяться с аналитом образца (продукты ПЦР, антигены, антитела). Затем для детекции и количественного определения используется вторая флуоресцентная метка. Каждый тип микросфер, будь то флуоресцентные полистироловые (диаметр 5,6 мкм) или магнитные микросферы (диаметр 6,2 мкм), отличается от остальных определённым количеством флуоресцентного красителя (от 1 до 3 красителей) в микросфере. После присоединения аналита к лиганду добавляется другая флуоресцентная метка, обычно это фикоэритрин (PE), присоединённый к стрептавидину (SA). Затем SAPE присоединяется к биотинилированному вторичному (детектирующему) антителу или включен в продукт реакции ПЦР, будучи связанным с биотинилированнымдезоксирибонуклеотидом (dNTP) или биотинилированным ПЦР-праймером. (Рис. 2) После присоединения флуоресцентной метки с помощью измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI) становится возможным определить «положительна» или «отрицательна» проба по аналиту, а с помощью калибровочной кривой проводят количественное определение. 


Рисунок 2. Основные форматы МСМА. A. МСМА на основе ПЦР (красные линии = нуклеиновые кислоты; зеленый круг = стрептавидин-фикоэритрин [SAPE]); B. "сэндвич"-метод МСМА (темно-синий овал = аналит; «Y» синий/розовый-это антитела, покрывающие микросферу, и детектирующие антитела, меченные биотином, связанным с SAPE [зеленый круг]); C. МСМА, основанные на ферментативной реакции (светло-зеленый круг = фермент; микросфера покрыта субстратом фермента). Фермент добавляет молекулу, например фосфат (фиолетовый круг), который затем связывается с биотинилированным антителом к фосфату, получившийся комплекс детектируется с помощью SAPE (антитела, меченные SAPE [зеленый круг]). D. МСМА, основанный на рецепторе (желтый = рецептор, синий треугольник = лиганд). Для всех фигур: красный круг = одна микросфера для МСМА. 

Микросферный мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ 

Многие ветеринарные МСМА-наборы основаны именно на иммунном «сэндвич»-методе, так как в ветеринарии наиболее востребовано определение антител. В данном методе флуоресцентные микросферы мечены захватывающимимоноклональные антителами (mAbs) к аналиту. К микросферам добавляется сыворотка, слюна или другие образцы, содержащие аналит (например антитела к возбудителю). Белки, прикрепленные к микросферам, специфично связываются с аналитом. Следующий шаг – добавление вторичных биотинилированныхmAb (или биотинилированныхполиклональных антител) к иным эпитопам антигена, нежели захватывающие антитела. Вторичные mAbs необходимы для детекции флуоресцентным маркером SAPE (Рисунок 2B).
Кроме описанного «сэндвич»-метода в МСМА могут применяться и другие, аналогичные ИФА, методы, такие, например, как «конкурентный» метод, в котором за связывание с захватывающим антителом конкурируют аналит образца и меченный аналит.Дилюенты и промывочные растворы тест-систем разработаны таким образом, чтобы устранить ненужное воздействие белков сыворотки и плазмы на показатели анализа. 

Кроме иммунного микросферного мультиплексного анализа существуют, как видно из Рис.2, и другие разновидности, приспособленные для обнаружения отрезков ДНК или РНК, определения ферментативной активности или основанные на реакции рецептор-лиганд. 

Могут также различаться и микросферы в зависимости от того, с каким оборудованием планируется использовать тест-систему. Существуют микросферы, позволяющие анализировать образцы на проточных цитфлуориметрах, оснащенных одним лазером на 488 нм или двумя (на 488 нм или 532 нм и 633 нм), и магнитные микросферы, также меченные уникальными количествами красного красителя, используемые в работе с анализатором MAGPIX. 

Оборудование, стоимость, анализ и интерпретация

Оборудование

Оборудование для микросферного мультиплексного анализа использует 2 источника света, один из них возбуждает 2 или 3 флуоресцентных красителя, определяющих тип микросферы, а второй возбуждает индикаторный краситель (обычно PE) присоединённый в процессе анализа. Оборудование способно определять до 100 или 500 аналитов в образце одновременно в 96- или 384-луночном формате соответственно, с небольшими поправками в зависимости от количества аналитов. В 2010 был представлен аппарат на уменьшенной платформе, в его основе лежит принцип детекции флуоресценции, но используется более экономически эффективный ридер со светодиодами (LED) вместо лазеров. Данный уменьшенный инструмент требует использования магнитных микросфер, так как он является уже не прибором типа проточного цитофлуориметра, а «отображателем флуоресценции». Лазеры и фотоэлектронные умножители были заменены на более экономичную и компактную CCD-камеру, способную одновременно обнаруживать до 50 аналитов. Стадии анализа, предшествующие чтению результатов на оборудовании для МСМА, удобно проводить с помощью автоматизированных систем для инкубации и отмывки магнитных микросфер, при этом большую часть стадий можно выполнить при помощи планшетного промывателя для ИФА с магнитной платформой. 

Стоимость

Стоимость тестирования в случае использования МСМА снижается за счёт возможности тестирования большого количества образцов и увеличения количества определяемых аналитов в одном образце. К примеру, при изучении цен дистрибьютора было отмечено, что стоимость 1 показателя для 1 образца ниже для 30-параметровой панели, чем для 5-параметровой (в данном случае стоимость 1 показателя 1 образца почти в 2 раза выше в 5-параметровом наборе). Одно генотипирование с исследованием 2000 образцов и обнаружением 15 ОНП (однонуклеотидных полиморфизмов, SNP) с помощью МСМА показало минимальную стоимость реагентов, которая снижается при увеличении количества аналитов и количества образцов. Как ранее уже отмечалось, различные инструменты способны определять до 50, 100 или 500 аналитов в одном образце одновременно в 96- или 384-луночном формате с некоторыми условиями при увеличении количества аналитов. 50-, 100- и 500-аналитные МСМА представлены в 96- и 348-луночном формате со следующим ориентировочным «временем чтения» в зависимости от оборудования: 60, 40 или 20 минут на 96-луночный планшет или 75 минут на 384-луночный планшет. Оборудование для МСМА, определяющее одновременно до 50 аналитов (MAGPIX), примерно в два раза дешевле других инструментов, занимает меньше места в лаборатории и использует меньше реагентов. Для сравнения,с помощью ПЦР в реальном времени,на момент написания статьи, возможно определение до 6аналитов с использованием 6 различных флуорофоров, но с определёнными сложностями, связанными с тем, что для сохранения чувствительности и специфичности при увеличении числа аналитов могут понадобиться дополнительные настройки по буферам, ферментам и прочим реагентам. 

Анализ и интерпретация 

 В МСМА флуоресцентный сигнал PE пропорционален количеству связанного аналита. Программа анализатора идентифицирует каждую группу микросфер, строит калибровочную кривую и вычисляет концентрацию образца. Концентрация образца вычисляется на основании значения MFI (средняя интенсивность флуоресценции) в соответствующих единицах измерения (например, пг/мл или отношение S/P) по калибровочной кривой. 

 Для получения более широкого диапазона определяемых концентраций образцов (по сравнению с линейной регрессией) при использовании единого набора стандартов смеси аналитов для иммунного «сэндвич»-анализа рекомендуется использовать 5-параметровую логистическую регрессию. 

 Большинство анализаторов оснащены соответствующим программным обеспечением для интерпретации результатов, либо возможно использование дополнительных программ для анализа полученных данных, которые предлагаются производителями либо тест-систем, либо оборудования. 

 Интерпретация результатов при обнаружении нескольких аналитов может представлять определённые трудности, как и при любом тестировании с несколькими аналитами. Например, может быть довольно трудно определить, были ли причиной клинических проблем один или несколько патогенов, представленных в Панели Желудочно-кишечных патогенов (GPP), или же один из патогенов был скрыт в течение длительного времени и оказался обнаружен только при проведении МСМА. Поэтому, прежде чем проводить анализ, важно определить несколько вероятных сценариев, на которые могут указать результаты, и определиться как их интерпретировать. В таких интерпретациях важны клинические и контекстуальные знания для того, чтобы определить, указывает ли присутствие возбудителя или антител к нему на заболевание. 

Оптимизация анализа и образцов 

Для оптимизации образцов и процедуры анализа требуется рассмотреть множество вопросов и шагов. Например, в случае мультиплексных иммунологических анализов важны такие стадии, как подбор специфических моноклональных или поликлональных антител для захвата и детекции, определение эффективности связывания первичного МАТ, оптимизация времени инкубации и концентраций захватывающих и детектирующих антител, сравнение одиночных и мультиплексных тестов, проверка кросс-реактивности реагентов, определение точности (меж- и внутрилабораторная сходимость), проведение сравнений с тестами, считающимися «золотым стандартом», определение динамического диапазона и пределов обнаружения (аналитической и диагностической чувствительности), специфичность, а также проведение тестов с использованием клинических образцов «с известным статусом». 

Сравнение МСМА с ИФА 

Невозможно не сравнить мультиплексный микросферный иммунофлуоресцентный анализ с традиционным ИФА, так как в современной ветеринарной серологической диагностике «золотым стандартом» является именно ИФА-метод, принцип которого, по сути, лежит и в описываемом методе мультиплексного анализа. Было бы идеально, если б в ИФА-наборах и наборах МСМА использовались одни и те же пары антител, так можно было бы сравнивать абсолютные количества антигенов в обоих типах тестов. Однако из-за параметров тестов могут быть различия между парами антител и разбавителями образцов, что, вероятно, является причиной наблюдаемых различий между 2 типами тестов и среди различных комплектов МСМА. Было проведено сравнение нескольких отчетов МСМА-наборов от различных поставщиков и, в то время как разные наборы показали различные абсолютные концентрации цитокинов, каждый из них показал сопоставимые между собой относительные тенденции в концентрациях цитокинов. 

На данный момент коммерческие МСМА-наборы, как правило, сравниваются с традиционными наборами ИФА и неизменно показывают чёткую корреляцию результатов. 

Если говорить об очевидных различиях методом ИФА и МСМА, то в первую очередь это существенно большая чувствительность метода МСМА за счёт гораздо большей площади поверхности, покрытой захватывающими антителами (около 106 ), чем площадь микролунки планшета традиционного ИФА. Кроме тогов традиционном ИФА для детекции используется фермент (пероксидаза), который, как и все ферменты, очень чувствителен к условиям среды (температура, pH и пр.), а в МСМА детекция происходит посредствам флуоресценции, без работы ферментов, что повышает надёжность процедуры анализа.