8(495)120-60-59
г. Москва, Научный проезд, дом 17, офис 5-2

Видео

21.02.2017 AgraQuant Mycotoxin ELISA

21.02.2017 AgraStrip Allergen

21.02.2017 AgraStrip Gluten G12

Новости

Микросферный мультиплексный анализ в ветеринарной диагностике (часть 2)

Микросферный мультиплексный анализ в ветеринарной диагностике (часть 2)


Ярослав Алексеевич Губин
, ветеринарный врач-биохимик, ведущий менеджер ООО "ЗИПИ" (г. Москва)
Александр Валентинович Машнин, к.в.н., руководитель проектов ООО "ЗИПИ" (г. Омск)
Дмитрий Валентинович Машнин, к.в.н., региональный представитель компании ООО "ЗИПИ" по Приволжскому и Уральскому федеральным округам (г. Омск)
Владимир Сергеевич Городов, к.б.н., старший научный сотрудник ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологии РАН (СФНЦА РАН) Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (п. Краснообск, Новосибирская обл.)

На основании статьи: Christopher Hennings J., Araujo K.P., Souza C.J., Fang Y., Lawson S., Nelson E.A., Clement T., Dunn M., Lunney J.K. Opportunities for bead based multiplex assays in veterinary diagnostic laboratories. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25:671 – 691. 10.1177/1040638713507256.
Микросферный мультиплексный анализ (МСМА) применяют для одновременного обнаружения в одном небольшом объеме пробы от нескольких до 50 – 500 аналитов. Преимущество подобных МСМА заключается в большем количестве данных, получаемых приблизительно при тех же лабораторных затратах, что и при иных методах выявления антигенов и антител. Ветеринарные МСМА можно использовать для обнаружения патогенов, генотипирования, определения уровня гормонов, для контроля заболеваемости и оценки результатов вакцинации. В материалах статьи суммируются данные о технологии МСМА и некоторых доступных на сегодняшний момент мультиплексных микросферных диагностических наборах для ветеринарии.
Ключевые слова: микросферный анализ, цитофлуорометрический микросферный анализ, Luminex, диагностика, xMAP, мультиплекс.

Beadbased multiplex assays in veterinary diagnostic Ya.A. Gubin, A.V. Mashnin, D.V. Mashnin, V.S. Gorodov 
Bead-based multiplex assays (BBMAs) are applicable for high throughput, simultaneous detection of multiple analytes in solution (from several to 50 – 500 analytes within a single, small sample volume). In veterinary medicine, various nucleic acid and protein-coupled beads can be used in, or for the development of, antigen and antibody BBMAs, with the advantage that more data can be collected using approximately the same amount of labor as used for other antigen and antibody assays. Veterinary-related BBMAs could be used for detection of pathogens, genotyping, measurement of hormone levels, and in disease surveillance and vaccine assessment. The current review summarizes the BBMA technology and some of the currently available BBMAs developed for veterinary settings. Key words: bead assay, cytometric bead array, Luminex, diagnostics, xMAP, multiplex.

     Современные реалии интенсивно развивающихся отраслей животноводства, таких как птицеводство и свиноводство, все чаще ставят перед диагностическими лабораториями задачу – в сжатые сроки при анализе минимальных количеств образцов и финансовых затрат получить максимально объективные сведения об обстановке на предприятии. Традиционная технология ИФА порой уже не способна справляться с вышеуказанными целями. В связи с этим интерес представляет современная технология мультиплексного анализа (МСМА), позволяющая одномоментно определять сразу несколько аналитов при исследовании одного образца. Данное диагностическое направление нашло широкое применение в медицинской клинико-диагностической практике, как для диагностики инфекционных болезней человека, так и при установлении различных биомаркеров в онкологии и иммуногенетике.
     Тестнаборы для диагностики заболеваний свиней. На данный момент большая часть диагностических МСМА сфокусирована на обнаружении антител к специфическим патогенам. Ниже приведены примеры существующих и востребованных наборов для мультиплексного анализа.
      Панель респираторных вирусных заболеваний свиней. В настоящее время серьезной экономической проблемой для свиноводства стал комплекс респираторных заболеваний свиней, который вызывают в совокупности многие неинфекционные и инфекционные факторы, включая вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), гриппа свиней типа А и цирковирус свиней 2 (ЦВС-2). Антитела к перечисленным возбудителям определяют постоянно для мониторинга статуса стада или оптимизации программы вакцинации. Благодаря появлению специализированного МСМА-набора, стало возможным в одной пробе одновременно выявлять антитела сразу ко всем 3 вирусам. Анализ на ВРРСС (причем антитела дифференцируются на ВРРСС тип 1 и 2), грипп тип А и ЦВС-2 в одной пробе позволяет существенно экономить рабочее время, расходные материалы и реагенты, а стоимость анализа сравнима с традиционным ИФА.

    Преимущества использования подобного инструмента комплексной диагностики для ветеринарного врача не ограничены элементарной экономией. На основе данных одного мультиплексного анализа можно:
– обоснованно подойти к выбору вакцины для контроля РРСС в зависимости от установленного генотипа вируса РРСС (тип 1 или 2);
– одномоментно контролировать иммунный ответ на вакцинный штамм вируса РРСС и дифференцировать его от гетерологичного по генотипу полевого штамма вируса РРСС, циркулирующего на привитом поголовье; – определять однородность иммунного ответа при вакцинации ЦВС-2 и гриппа типа А; 
– иметь представление об источнике респираторной и репродуктивной патологии (вирус РРСС тип 1 и 2), иммуносупрессии (ЦВС-2) и инициирующем их агенте – вирус гриппа тип А.

    Анализ актинобациллярной плевропневмонии (АПП). АПП – остается важным респираторным инфекционным заболеванием свиней, которое быстро распространяется воздушно-капельным путем, а также при непосредственном контакте животных. Оно наносит значительный экономический ущерб вследствие замедления роста и смертности поголовья. Различают пятнадцать серотипов АПП, они разделены на девять серо-рупп (APP1-9-11, APP2, APP3-6-8-15, APP4-7, APP5, APP10, APP12, APP13 и APP14). Как правило, статус поголовья свиней на АПП определяют с помощью детекции серотипо- или серогруппоспецифичных антител в образцах сыворотки.      Для этих целей разработано несколько ИФА-тестов. Наиболее чувствительные и специфичные из них – непрямые ИФА с использованием длинноцепочечных липополисахаридов (LC-LPS) в качестве антигенов. Для выявления антител к 9 серогруппам АПП необходимо провести соответствующее количество ИФА-тестов. Сейчас есть альтернатива – коммерческий набор для мультиплексного анализа на серогруппы АПП. Он позволяет одновременно в одной лунке определять 7 серогрупп (APP1-9-11, APP2, APP3-6-8-15, APP4-7, APP5, APP10 и APP12). 
    Тестнаборы для диагностики заболеваний птицы. Птицеводство – отрасль с огромным поголовьем, а значит, и с большим количеством исследуемых проб. Скорость производственных циклов, быстрый ответ птицы в случае инфекции в виде снижения продуктивности и смертности, ограниченное количество материала, который можно отобрать в качестве пробы – все это является предпосылками для использования мультиплексного анализа. Пожалуй, МСМА-наборы являются самыми востребованными именно в птицеводстве. Существующие тест-системы позволяют ветеринарному специалисту составлять комплексное представление об инфекционном статусе поголовья, а также контролировать иммунный ответ на вакцинопрофилактику и планировать дальнейший график иммунизации исходя из полученных данных.
     Набор для выявления антител к вирусам инфекционной бурсальной болезни (IBDV), инфекционного бронхита (IBV), ньюкаслской болезни (NDV) и реовирусу птиц (REO) – один из коммерчески доступных серологических мультиплексных тестов обнаруживает антитела к 4 вирусам. Этих возбудителей объединяет высокая контагиозность и экономические потери, к которым приводят вспышки данных инфекций в хозяйствах. Для этого анализа требуется 50 мкл разведенной 1:500 сыворотки, что является преимуществом перед другими серологическими тестами из-за малых объемов образца. Тест занимает примерно 3 ч и включает в себя группу контрольных микросфер, подтверждающих внесение вторичного антитела и сыворотки в ходе реакции. Исследования показали, что результаты МСМА и ИФА при тестировании идентичных образцов в одинаковых условиях были эквивалентны (R2>0,99).
     Анализ позволяет оценивать титры антител к каждой из 4 инфекций – это привычный инструмент оценки проведенной вакцинации и планирования дальнейших профилактических мероприятий.
     Набор для выявления антител к Mycoplasma synoviae и Mycoplasma gallisepticum. Продуктивная птица восприимчива к разным респираторным инфекциям, включая несколько видов микоплазм. Наиболее значимыми из них являются Mycoplasma synoviae (Ms) и Mycoplasma gallisepticum (Mg). Ms и Mg обусловливают респираторные хронические инфекции, особенно при стрессовых условиях среды и/или наличии других респираторных патогенов (вирусов, бактерий). Штаммы Mg и Ms различаются по вирулентности и инфекции, вызываемые ими, обычно клинически проявляются в виде острого ринита, конъюнктивита и кашля, но в некоторых случаях могут протекать без внешних проявлений. Mycoplasma synoviae может вызывать синовит. В верхних дыхательных путях скапливается избыточное количество слизистого экссудата, а в воздушных мешочках иногда – фибринозно-гнойный экссудат (aerosac-culitis). Микоплазмозы могут приводить к снижению продуктивности, замедлению роста бройлеров и снижению яйценоскости кур-несушек. Инфекции, вызываемые Ms или Mg, диагностируют путем обнаружения микоплазм в клинических образцах и с помощью определения антител к ним в сыворотке крови. При культивировании Ms и Mg на специальных питательных средах делают смывы с тканей или их гомогенаты, используют экссудат и аспират из суставной полости. Для детекции микоплазм в клиническом материале или выделенной культуре также применяют молекулярные (обнаружение ДНК) методы на основе ПЦР, которую считают более чувствительным методом, так как выделенные культуры часто подвергаются бактериальной контаминации. Для серологической диагностики Mg и Ms существует несколько тест-наборов. Их чаще используют для скрининга птичника, чем для тестирования индивидуальных образцов. Как правило, это реакция агглютинации (РА) на планшете, реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментный анализ (ИФА). РА обладает низкой специфичностью и статус сомнительных или положительных проб необходимо подтверждать с помощью ИФА или РТГА. В отличие от РА и РТГА ИФА-анализ легко поддается автоматизации и очень хорошо подходит для тестирования большого количества проб.
    Сейчас с помощью метода микросферного мультиплексного анализа возможен скрининг одной небольшой пробы в одной лунке одновременно на несколько антител к разным антигенам. Доступен коммерческий тест-набор, позволяющий одновременно дифференцированно выявлять антитела к Ms и Mg в одной лунке. При этом требуется 1 мкл сыворотки. Анализ занимает примерно 2,5 часа. Данный тест- набор продемонстрировал высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость в сравнительных испытаниях с ИФА и РТГА.      
    Другие наборы. Метод микросферного мультиплексного анализа за счет своих преимуществ оказался востребован во многих областях лабораторной диагностики. В первую очередь это исследования, требующие комплексной оценки большого числа показателей. Поэтому в ветеринарии применение МСМА не ограничено обнаружением антител к инфекционным возбудителям. Уже разработаны и используются тест-системы для диагностики грибковых инфекций, выявления и типирования пищевых патогенов, таких как E. coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes и Campylobacter jejuni, обнаружения различных примесей в пищевых продуктах и сырье. Например, созданный МСМА-набор для выявления антибиотиков в молоке способен одновременно в одной пробе обнаруживать тетрациклин, гентамицин, стрептомицин, хлорамфеникол и тилозин. Есть тест-системы для комплексного мониторинга гормонов и факторов роста в мясе. Разработан тест-набор для одновременного определения 6 микотоксинов в пробе корма или кормового сырья. На данный момент подобные анализы чаще проводят с помощью ИФА, при этом для каждого из микотоксинов приходится использовать отдельную тест-систему. 
     Определение иммунного ответа стада на вакцинацию не ограничивается мониторингом уровня специфических антител, это позволяет сделать анализ уровней интерлейкинов в сыворотке. Уже существует МСМА-набор для тестирования интерлейкинов и других цитокинов свиней, позволяющий в одном анализе оценить статус пробы по 13 показателям (GM-CSF, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL- 4, IL-6, IL-8/CXCL8, IL-10, IL-12, IL-18, TNFα). Подобные инструменты способны помочь производителям создавать более совершенные вакцины, опираясь на комплексные подробные данные об иммунном ответе на их препараты. 
     Перспективы МСМА в ветеринарии.Помимо большей информативности МСМА, по сравнению с классическим ИФА, использование микросферного мультиплексного анализа предпочтительнее и с сугубо экономической точки зрения. При классическом ИФА и МСМА для тестирования одних и тех же показателей требуется разное количество соответствующих наборов. Если речь идет о контроле болезней свиней, указанных выше, то индивидуальных наборов ИФА потребуется 4 – ВРРСС (тип 1 и 2), грипп типа А и ЦВС-2, а при применении мультиплексного анализа – только 1 набор. При этом анализ цен дистрибьюторов различных ИФА-наборов и наборов для мультиплексного тестирования показал, что стоимость последнего сопоставима с таковой ИФА-набора на один из показателей. Это относится и к наборам для контроля инфекций птиц. Вместо 6 индивидуальных наборов ИФА для контроля ИБК, ИББ, НБ, РЕО, гриппа тип А, Mg/Ms, потребуется всего лишь 2 набора МСМА для тестирования антител к возбудителям вышеуказанных инфекционных патологий. 
     Заключение. Метод микросферного мультиплексного анализа – универсальная платформа для решения комплексных диагностических задач, дающая полную детальную информационную картину, не затрачивая при этом избыточных средств и времени на классические "точечные" методы исследования. Принимая во внимание наличие на рынке валидированных коммерческих антигенов различных возбудителей болезней животных и птиц, коммерческих микросфер и стандартизированность процедуры нанесения антигенов на поверхность микросфер, перспективность МСМА очевидна и не вызывает сомнений. 

УДК 619:616-078:576.8 
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА – ВАЖНЫЙ ЭТАП АНТИМИКРОБНОЙ ТЕРАПИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ 

Галина Александровна Бирюкова, специалист по птицеводству
Светлана Глебовна Дорофеева, к.в.н., заместитель генерального директора по ветеринарии ГК ВИК Важнейшими условиями правильного выбора антибактериальных препаратов для лечения сельскохозяйственной птицы являются мониторинг циркулирующих в хозяйствах патогенных возбудителей и определение их чувствительности к антимикробным препаратам. Такой подход позволяет предотвратить заболевание и падеж птицы, а также избежать дополнительных экономических расходов. 
Ключевые слова: бактерии, эпизоотическая ситуация, резистентность бактерий, бактериальный фон, антибактериальные препараты. 

Bacterial diagnosis is an important step in the management of antimicrobial therapy in poultry G.A. Birukova, S.G. Dorofeeva 
Main points of choosing antimicrobial product for treatment in poultry are diagnostic monitoring of circulating pathogens and determination of sensitivity of isolates to drug. A professional approach to the treatment of diseases of bacterial etiology in poultry helps to prevent the disease and to avoid additional economic costs. Key words: bacteria, epizootic situation, bacterial resistance, bacterial background, antibacterial drugs.